تتبع الأيض بواسطة NMR

يشارك الباحثون نصائحهم سواء كان في محاذاة مواد معدة للاستخدام أو تحضير العينات، لدراسة التمثيل الغذائي باستخدام هذا النهج الذي لا يستخدم بكثرة، وسنعرف اليوم كيفية تتبع الأيض بواسطة NMR.

تتبع الأيض بواسطة NMR

يقول جيفري هوك Jeffrey Hoch، عالم بعلم الأحياء البنيوية والفيزياء الحيوية في جامعة كونيتيكت University of Connecticut:

• إذا كنت تريد أن تفهم حالة الكائنات الحية، فإنّ أفضل ما يمكن فعله هو النظر إلى التركيز اللحظي لكل المواد الكيميائية التي تنتجها.

تستخدم تقنية مطياف الكتلة والتي يطلق عليها اسم ميتابولوم Metabolome بكثرة في تصوير هذه الحالة الكيميائية.

يقول الباحثين في علم الأيض، مثل هوك:

• إن علماء الأحياء ينبغي أن يكتسبوا أيضاً مزايا تقنية لا تستخدم بكثرة إلى حدٍ ما، وهي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي NMR.
• تتناسب قوة إشارة الرنين مع كمية المستقلب في العينة، سواء كانت مصل أو أنسجة في المختبر أو في فأر حي.

لدى الرنين النووي المغناطيسي حساسية أقل من المواصفات الكتلية.

ولكن، هذه ليست مشكلة بالمقارنة مع غزارة الأيض والرنين النووي المغناطيسي له مزايا فريدة من نوعها.

• لا تدمر هذه الطريقة العينات رغم أنها تكون العينة المدروسة دقيقة نسبياً.

يمكن للباحثين استخدام التوقيعات الأيضية التي تتبعها الرنين النووي المغناطيسي لتطوير تشخيصات جديدة للمرض واكتشاف غايات جديدة للعقاقير. ولكن لا يزال الكثير حول عملية تتبع الأيض غامضاً، ويحاول الباحثون في عمليات تتبع الأيض جعل هذه الطريقة في متناول علماء البيولوجيا (علم الأحياء).

الرنين النووي المغناطيسي في صندوق

• المشروع:

جعل برنامج استقلاب الرنين النووي المغناطيسي أسهل للتنقل.

• المشكلة:

البدء بالرنين المغناطيسي بالنسبة لأي عالم وبشكل خاص بالنسبة إلى علماء الأحياء، يمكن أن يكون مرعباً.

يقول هوك:

• “لإعداد مخبر الرنين النووي المغناطيسي جديد من الصفر، تحتاج إلى أشهر للعثور على البرنامج وتجميعه وتثبيته والخبرات الفنية للحفاظ عليه.”

ويقول أيضاً:

• إنّ بيانات الرنين النووي المغناطيسي الخام تشبه الجوقة. للعثور على الأصوات الفردية-القمم الطيفية، التي تم إجراؤها بواسطة نوع معين من الجزيئات وتتطلب العديد من حزم البرامج.

اعتماداً على البروتوكول التجريبي وماهية المستقلبات الأكثر أهمية لدراسة معينة، يحتاج علماء الأحياء إلى:

• توليفات مختلفة من حزم البرامج .

إن معرفة أي برنامج لاستخدامه يمثل تحدّياً بالنسبة لأولئك الذين لايملكون خلفية في الفيزياء أو الكيمياء التحليلية. يقول هوك، حتى مع وجود موظفين مدربين تدريباً عالمياً والكثير من الموارد، هناك تحديات نسبية.

على سبيل المثال:

قد يقوم أحد العاملين بتشغيل برنامج metabolomics والذي يتوقف عن العمل بعد تحديث نظام التشغيل، أو تركه لأشهر دون عمل أو جعل التجارب الماضية غير قابلة للتكرار.

• الحل:

مع منحة من المعاهد الوطنية للصحة NIH، قام هوك والمتعاونون بتطوير NMRbox الذي يمكّن علماء الأحياء استخدامه للعثور على البرامج المناسبة وتحليل بيانات الرنين النووي المغناطيسي الخاصة بهم باستخدام الحوسبة السحابية. يستضيف المشروع حاليًا حوالي ١٦٠ مجموعة برامج، ولديه أكثر من ١٠٠٠ مستخدم.

NMRbox يخزن أيضًا ويتيح الإصدارات القديمة (أو حتى المتوقفة) من البرامج، مما يزيد من استنساخ الدراسات. تقوم خوادم NMRbox بتخزين البيانات التجريبية للمستخدمين في ثلاثة مواقع، في حال فشل أحد الخوادم. كما يستضيف مختبر لودسشويلر Brüschweiler’s حزمة برمجية أخرى محولة من المعاهد الوطنية للصحة، كولمار COLMAR، كولمار عبارة عن مجموعة من الأدوات للمرحلة الثانية من دراسات الاستقلاب، باستخدام التحليل الطيفي الرنين النووي المغناطيسي لتخليل القمم الطيفية في البيانات للحصول على معلومات ثابتة عن أهمية التمثيل الغذائي.

• جرّبها:

يتوفر كل من COLMAR و NMRbox مجانًا عبر الانترنت. يقول هوك: “يمكن للمستخدمين تحرير الإطارات وتحديد الطريقة المثلى.”

الاستمرارية

• المشروع:

لدراسة ومقارنة النشاط الأيضي لأنسجة السرطان من المرضى والمستمدة من المرضى نمت في الفئران xenografts على مدى فترات زمنية طويلة.

• المشكلة:

على عكس المواصفات الجماعية، فإنّ طيف الرنين النووي المغناطيسي هو غير تدميري، لذلك يمكن استخدامه للتحقيق في الديناميات الأيضية في الحيوانات الحية. لكن الدراسات طويلة الأجل لا تزال صعبة لأنّ بروتوكولات الجرعات الحالية تتطلب حصر جسدي أو تخدير، كلاهما صادمان للحيوانات، ويمكنهما أيضًا التأثير على جودة البيانات والحد من طول وتواتر القياسات الأيضية. تعني الأطر الزمنية قصيرة بالضرورة أنه من شبه المستحيل استخدام الرنين النووي المغناطيسي النووي لدراسة العمليات طويلة المدى، مثل كيفية تغير عملية استقلاب الورم بمرور الوقت. وبسبب هذه القيود الزمنية يتم تسجيل عمليات تتبع الأيض السريعة فقط. تقول Teresa Whei-Mei Fan تيريزا فان: “يمكنك فقط رؤية التحلل أو دورة كريبس”. العمليات البطيئة أكثر، مثل توليف النوكليوتيدات والبروتين غير مرئية، لأنّ ذلك يستغرق أكثر من بضع ساعات لدمج كميات قابلة للقياس من ¹³C أو نظائر أخرى، المواد الخام الأيضية المستخدمة كعلامات في مثل هذه الدراسات.

• الحل:

طورت فان وزملائها بروتوكولًا لتسليم علامات النظائر مثل ¹³C بشكل غير مألوف في تغذية الحيوانات، مما يسمح لهم بزيادة مدة دراسات التمثيل الغذائي الخاصة بهم وتوصيف المسارات البطيئة. جمع الباحثون جلوكوز ¹³C من مختبرات كامبردج مع قاعدة غذائية سائلة من مختبرات هارلان، واستخدم هذا المزيج لدراسة التمثيل الغذائي للمستحضرات المستمدة من فئران التجربة. تناول الفئران الأعلاف التي تحتوي على الجلوكوز لمدة ١٨ ساعة. ثم استخدمت مجموعة فان الرنين النووي المغناطيسي لمقارنة عملية التمثيل الغذائي للفئران مع أنسجة الورم المأخوذة مباشرة من المرضى.

رأي فان

تقول فان إنّ هذا النوع من الدراسة يمكن أن يساعد في اكتشاف الاختلافات الأيضية التي قد تساهم باكتشاف أدوية جديدة. بعد ذلك، تعتزم استخدام هذه الطريقة لدراسة إنتاج الدهون في الورم وكيفية تحركها عبر الجسم، مما يحتمل وضع الأساس للنقائل. تقول فان إنّ وضع العلامات من خلال تغذية الحيوانات قد يسهل على علماء الأحياء الذين لديهم خبرة أقل في الرنين المغناطيسي النووي وخبرة أقل في التعامل مع الحيوانات لإجراء هذه الأنواع من الدراسات ومتابعة التغيرات الأيضية طويلة المدى في السرطان ولأغراض أخرى . وقالت: “يتطلب حقن ملصقات النظائر في الوريد الذيل مهارة خاصة، لكن هذا لا يعني حقًا.”

اختبار الطاقة

• البرنامج:

القياس المتزامن للأنزيمات المساعدة.

• المشكلة:

تشكل الأكسدة وخفض الأنزيمات المساعدة بما في ذلك ATP و NAD بعض أهم التفاعلات الكيميائية الأساسية في الحياة. يقول دانيال رافتيري Daniel Raftery:” هذه التفاعلات في كل مكان تقريبًا.” تحدد المستويات النسبية لكل من ATP و ADP و AMP مخازن طاقة الأنسجة، وينظم كل من +NAD و NADH و NADH+ و NADPH القنوات الأيونية وإشارات الخلايا وموت الخلايا. لكن قياس الوفرة المتزامنة لهذه الجزيئات وأنزيماتها المشتركة أمر صعب لأن كتلتها متماثلة تقريبًا. يختلف NAD+ وNADH بوجود بروتون واحد فقط مما يجعل من الصعب التمييز بينها باستخدام مطياف الكتلة. و ATP يفقد بسهولة مجموعات الفوسفات خلال معالجة العينات ويتحول إلى ADP أو AMP.

• الحل:

يقول رافتيري: “يمكن للرنين المغناطيسي النووي بأن ينظر إلى كل هذه في نفس الوقت، لكن القمم في الطيف لم تكن واضحة من قبل.”

طورت مجموعة رافتيري من الباحثين أساليب قياس جميع الأنزيمات المشتركة السبعة باستخدام الرنين النووي المغناطيسي المتناغم مع الهيدروجين. حيث تم دراسة طرق إعداد العينات بعناية ووجد أنها ساعدت في إضافة الكلوروفورم إلى محلول الميثانول المعتاد المستخدم لاستخلاص المستقلبات القابلة للذوبان في الماء من الأنسجة. طور الباحثون أيضًا جيل للعمل مع أنسجة معينة. تجميد القلب قبل إزالته من الفأرة على سبيل المثال، يساعد في منع انهيار ATP  أثناء تحضير العينة. في الأجهزة الأخرى لم يكن هذا ضروريًا. ذهب العلماء لبرهان طفرات طيفية مميزة للمركبات، وقياس الوفرة في أنسجة قلب الفأرة وكذلك مستويات الأيض في الكلى والدماغ والكبد والعضلات والهيكل العظمي. بعد ذلك جمعت المجموعة هذه الطريقة مع طرق الاستقلاب الأخرى لإجراء الدراسة الأكثر شمولية من المستقلبات في دم الإنسان حتى الآن Anal Chem.

• جربها:

يقول رافتيري إنّ علماء الأحياء الذين يريدون استخدام ¹H NMR  لقياس هذه الأنزيمات المساعدة يمكنهم استخدام وصفات تحضير العينات والبصمة الطيفية في بحثه لعام ٢٠١٦، والاتصال به مع أي أسئلة. ستعمل الطريقة على أفضل وجه مع ١٠ ملليغرامات أو أكثر من الأنسجة، لكن رافتيري يأمل أن يكون من الممكن في نهاية المطاف إجراء هذه القياسات في الجسم الحي ربما مع التقدم في طرائق التحليل الطيفي التي تستخدم الليزر أو الموجات الدقيقة لزيادة إشارة جزيء الفائدة . ويقول إن مجموعته الآن تستكشف حساسية الطريقة في الخلايا المطلية.

قراءة واضحة

• المشروع:

إزالة البروتينات من العينات للحصول على إشارة من الرنين النووي المغناطيسي أوضح.

• المشكلة:

يمكن أن تجعل البروتينات في العينات من المستحيل تقريبًا إجراء عمليات تتبع الأيض عبر الرنين النووي المغناطيسي، ويمكن أن يكون إخراجها أمرًا صعبًا نظرًا لكونها بنسب كبيرة، تتسبب البروتينات في حدوث تشوهات على طول الطيف، مما يؤدي إلى تشوش قمم NMR حاد ناتجة عن جزيئات فردية صغيرة. يقول رافائيل بروشويلر Rafael Brüschweiler: “إذا كان هناك بروتينات موجودة ونحصل على قمم كبيرة جدًا وصعب معرفة مكان هذه الأصداء (الرنين) وتحديد حجمها.” يمكن تصفية المصل، لكن البروتينات الوفيرة تسد الشاشات بسرعة. ومن الممكن أيضًا استخدام المذيبات العضوية لتدمير البروتينات وفصلها، ولكن هذا يعني التعامل مع المواد الكيميائية بما فيها الكلوروفورم والميثانول والتي يمكن أن تكون شاقة لبعض الباحثين.

يمكنك أيضًا الأطلاع على: تفاعلات الأكسدة والإرجاع

• الحل:

خرج بروشويلر بطريقة أسهل باستخدام الجسيمات النانوية التي تجذب البروتين عن طريق الصدفة. بالإضافة إلى عملهم على عمليات تتبع الأيض على الرنين النووي المغناطيسي، فإنّ بروشويلر وزملاءه يهتمون بدراسات الرنين النووي المغناطيسي بخصوص البروتين. بناءًا على حث طالب الدراسات الجديد Mouzhe Xie، كانت المجموعة تسعى لاستخدام الجسيمات النانوية لالتقاط ودراسة البروتينات المضطربة مثل α synuclein. لم تكن التجارب الأصلية كما هو مخطط لها، لكن الباحثين لاحظوا أنّ الجسيمات النانوية السيلكا (التي لها شحنة سطحية سلبية) لها صلة قوية بالجزيئات المشحونة إيجابيًا (مثل الليسين والأرجينين) و يمكن أن تسحب البروتينات بسرعة من المصل.

رأي بروشويلر

يقول بروشويلر :”لقد رأينا تغيرًا كبيرًا في طيف الرنين النووي المغناطيسي.” ذهب التشويش، و ظهر إشارة واضحة مع قمم NMR حادة من الجزيئات الصغيرة. تستخدم مجموعة بروشويلر الآن طريقة تحضير العينات من مصل الدم والأنسجة لتحليل الأيض ويقول إن المختبر يبحث حاليًا على مؤشرات الحيوية للأمراض بما فيها السرطان و مرض الزهايمر.

• جربها: يمكن شراء جسيمات السيليكا الغروية من شركات مثل أكزونوبل AkzoNobel. جمعت مجموعة بروشويلر ميلليتر من المصل البشري مع ٢٠٠ ميكروليتر من محلول جسيمات متناهية الصغر من السيليكا بنسبة ٤ بالمائة، طردت لمدة نصف ساعة عند ٤ درجة مئوية، جمع الراسب وكررت العملية.

المصادر:

How to Track Metabolites in Tissues Using NMR. The Scientist Magazine. Retrieved December 16, 2018, from https://www.the-scientist.com/lab-tools/how-to-track-metabolites-in-tissues-using-nmr-64465

Maciejewski MW & et al. NMRbox: A Resource for Biomolecular NMR Computation. Biophys J. 2017 Apr 25;112(8):1529-1534

Sun RC & et al. Noninvasive liquid diet delivery of stable isotopes into mouse models for deep metabolic network tracing. Nature Communications 2017; 8, Article number: 1646

Gowda GAN & et al. Simultaneous Analysis of Major Coenzymes of Cellular Redox Reactions and Energy Using ex Vivo ¹H NMR Spectroscopy. Anal. Chem., 2016, 88 (9), pp 4817–4824

Gowda GAN & et al. Whole Blood Metabolomics by ¹H NMR Spectroscopy Provides a New Opportunity To Evaluate Coenzymes and Antioxidants. Anal. Chem., 2017, 89 (8), pp 4620–4627

Zhang B & et al. Nanoparticle-Assisted Removal of Protein in Human Serum for Metabolomics Studies. Anal. Chem., 2016, 88 (1), pp 1003–1007